一、热图绘制原理

1.1 热图介绍

通常，热图用于对采集到的因子响应强度或其他一些因子进行归一化处理，从而利用颜色条的变化来直观地表示不同样本之间的内容变化。

其本质是一个由预设颜色代表数值的小方块组成的数据矩阵，通过对因子或样本进行聚类，可以观察到不同样本数据之间的相似性。

1.2 热图绘制准备——均一化

在绘制热图之前，通常会对数据进行归一化处理，使响应差异较大的因素处于同一数量级，以便于观察不同样本间不同因素的变化规律。

一般来说，一个因子在不同样本间的分布会在热图的行方向上进行展示，所以为了展示一个因子在不同样本间的分布，均一化处理会按 “row”进行。

详细的热图归一化和聚类参数说明，请参考：
用R包中heatmap画热图

1.3 热图绘制方式

常用的绘图软件：origin，excel，Tbtools，GraphPadPrism
在线绘图：metaboanalyst，云图图，Hiplot
R包绘制热图：pheatmap，heatmap，corrplot，complexHeatmap

有多种方法可以满足绘图需求。关键是要选自己舒服的，画出自己满意的效果，多练习！

1.4 热图数据查看示例

• 数据排列：横行对应复合数据，纵轴对应样本数据
  
  图1 数据输入准备
  
• 按行规范化
  ，即对每个样本中的因子分别进行标准化，
  突出显示该因素在哪个样本中更占主导地位
  
  图2 按行进行标准化
  
• 按列标准化
  ，即对每个化合物对应的样本进行归一化。
  
  图3 按列进行标准化
  

二、pheatmap包简介

2.1 pheatmap介绍

pheatmap：A function to draw clustered heatmaps where one has better control over some graphical parameters such as cell size, etc.

官方介绍：想对于heatmap包，pheatmap是图形绘制及参数修改更美观更严谨的一个热图包。

2.2 pheatmap详细参数解释

R中pheatmap包的参数内容如下：

pheatmap(mat, color = colorRampPalette(rev(brewer.pal(n = 7, name =
  "RdYlBu")))(100), kmeans_k = NA, breaks = NA, border_color = "grey60",
  cellwidth = NA, cellheight = NA, scale = "none", cluster_rows = TRUE,
  cluster_cols = TRUE, clustering_distance_rows = "euclidean",
  clustering_distance_cols = "euclidean", clustering_method = "complete",
  clustering_callback = identity2, cutree_rows = NA, cutree_cols = NA,
  treeheight_row = ifelse((class(cluster_rows) == "hclust") || cluster_rows,
  50, 0), treeheight_col = ifelse((class(cluster_cols) == "hclust") ||
  cluster_cols, 50, 0), legend = TRUE, legend_breaks = NA,
  legend_labels = NA, annotation_row = NA, annotation_col = NA,
  annotation = NA, annotation_colors = NA, annotation_legend = TRUE,
  annotation_names_row = TRUE, annotation_names_col = TRUE,
  drop_levels = TRUE, show_rownames = T, show_colnames = T, main = NA,
  fontsize = 10, fontsize_row = fontsize, fontsize_col = fontsize,
  angle_col = c("270", "0", "45", "90", "315"), display_numbers = F,
  number_format = "%.2f", number_color = "grey30", fontsize_number = 0.8
  * fontsize, gaps_row = NULL, gaps_col = NULL, labels_row = NULL,
  labels_col = NULL, filename = NA, width = NA, height = NA,
  silent = FALSE, na_col = "#DDDDDD", ...)

参数说明：

笔记：

1. colorRampPalette()需要调用R包** RColorBrewer_colors **，包括　“Blues BuGn BuPu GnBu Greens Grays Oranges OrRd PuBu PuBuGn PuRd Purples RdPu Reds YlGn YlGnBu YlOrBr YlOrRd” 连续调色板；
   
2. 标准化解释；
   
3. kmeans_k聚类解释；
   
4. “annotation_row”与”annotation_col”对行列进行注释时，要求数据格式为数据框，并且绘制热图时需要考虑设置颜色值的类型（连续值或离散值）；
   
5. 参数说明参考；
   

2.3 pheatmap安装及加载

通过以下代码安装并加载R包。

install.packages("pheatmap") # 安装包
install.packages("xlsx") # 安装包
library(pheatmap)  #加载包
library(xlsx)  #加载包

三、pheatmap包绘制热图示例

3.1 数据准备

随机准备的数据如图 4 所示，其中水平行代表样本，列代表因素。
存储为 “.xlsx”格式。

图4 数据准备

3.2 数据导入及绘图

3.2.1 数据导入及列名调整

按照以下代码输入数据，并赋给 “data1”：

# 数据导入
data1 <- read.xlsx("D:\\**自己的路径**\\R\\sample data.xlsx", sheetIndex = 1, check.names = F, encoding="UTF-8")

# sheetIndex表示选择.xlsx文件中的第1个sheet，可用于多个sheet的表格数据选择；check.names = F适用于表头存在一些特殊字符（＿等）的情况，避免输入R后产生错误

数据输入后如图5所示，需要将第一列的列名位置进行调换，否则会因为 “NA” 而报错，报错内容如下：

Error in hclust(d, method = method) : 外接函数调用时不能有NA/NaN/Inf(arg10)

图5 数据输入

列名调整代码：

rownames(data1) = data1[,1]　　　#给data1添加列名
data1 <- data1[,-1]　　　　　　#去除第一列的名称
data1 <- as.matrix(data1)

图6 列名调整后数据

3.2.2 热图绘制

3.2.2.1 基础热图及其标准化

使用以下代码绘制基本热图：

pheatmap(data1)　#绘制基础热图

图7 基础热图

在规范化行之后绘制：

pheatmap(data1, 
         scale = "row" # 按行归一化
         )

图8 标准化后热图

3.2.2.2 热图聚类及聚类树高和聚类热图划分隔断

按行选择“correlation”方法进行聚类绘图，并设置聚类高度以及按行隔断热图：

pheatmap(data1, 
        scale = "row", # 按行归一化，查看因子在不同样本中的分布情况
        cluster_cols = FALSE, clustering_distance_rows = "correlation", #取消列聚类，表示行聚类使用皮尔森相关系数聚类
        treeheight_row = 30, # 设置行聚类树高
        cutree_rows =3 #根据样品列聚类情况将热图的行方向隔开为3份
         )

图9 聚类并调整参数后的热图

3.2.2.3 热图单元格显示参数设置

3.2.2.3.1 热图单元格高度及宽度的设置

利用“cellwidth” 与 “cellheight”设置热图单元格的宽度和高度：

pheatmap(data1, 
        scale = "row", # 按行归一化，查看因子在不同样本中的分布情况
        cluster_cols = FALSE, clustering_distance_rows = "correlation", #取消列聚类，表示行聚类使用皮尔森相关系数聚类
        treeheight_row = 30, # 设置行聚类树高
        cutree_rows =3, #根据样品列聚类情况将热图的行方向隔开为3份
        cellwidth = 40,cellheight = 15 # 设置热图单元格宽度和高度
        )

图10 设置单元格宽度与高度之后的热图

3.2.2.3.2 热图单元格数值的显示

使用“display_numbers”参数设定是否在单元格上显示数值。

pheatmap(data1, 
        scale = "row", # 按行归一化，查看因子在不同样本中的分布情况
        cluster_cols = FALSE, clustering_distance_rows = "correlation", #取消列聚类，表示行聚类使用皮尔森相关系数聚类
        treeheight_row = 30, # 设置行聚类树高
        cutree_rows =3, #根据样品列聚类情况将热图的行方向隔开为3份
        cellwidth = 40,cellheight = 15, # 设置热图单元格宽度和高度
        display_numbers = T # 热图上显示数值
        )

图11 设置热图单元格显示数据

3.2.2.3.3 热图单元格数值大小颜色等参数设置

使用“fontsize_number”、“number_color”、“number_format”等参数设置热图单元格上数值的大小及颜色等。

pheatmap(data1, 
        scale = "row", # 按行归一化，查看因子在不同样本中的分布情况
        cluster_cols = FALSE, clustering_distance_rows = "correlation", #取消列聚类，表示行聚类使用皮尔森相关系数聚类
        treeheight_row = 30, # 设置行聚类树高
        cutree_rows =3, #根据样品列聚类情况将热图的行方向隔开为3份
        cellwidth = 40,cellheight = 15, # 设置热图单元格宽度和高度
        display_numbers = T, # 热图上显示数值
        fontsize_number = 8, #热图上数值的字体大小
        number_color="blue", #热图上数值的字体颜色
        number_format="%.1e", #热图上数值的字体类型
        )

图12 设置热图单元格显示数据的大小，颜色及类型

3.2.2.4 热图单元格区分标记

同样是使用 “display_numbers” 根据热图单元格的数值进行标记，若该单元格原始数值大于5000，则为 “***”，否则为 ” “：

pheatmap(data1, 
        scale = "row", # 按行归一化，查看因子在不同样本中的分布情况
        cluster_cols = FALSE, clustering_distance_rows = "correlation", #取消列聚类，表示行聚类使用皮尔森相关系数聚类
        treeheight_row = 30, # 设置行聚类树高
        cutree_rows =3, #根据样品列聚类情况将热图的行方向隔开为3份
        cellwidth = 40,cellheight = 15, # 设置热图单元格宽度和高度
        fontsize_number = 8, #热图上数值的字体大小
        number_color="blue", #热图上数值的字体颜色
        number_format="%.1e", #热图上数值的字体类型
        display_numbers = matrix(ifelse(data1 > 5000, "***", ""), nrow(data1))
        )

图13 设置热图单元格区分标记

3.2.2.5 热图美化

3.2.2.5.1 标题及行列标签

使用“main”，“show_colnames”，“show_rownames”添加标题及设置标签的显示：

pheatmap(data1, 
        scale = "row", # 按行归一化，查看因子在不同样本中的分布情况
        cluster_cols = FALSE, clustering_distance_rows = "correlation", #取消列聚类，表示行聚类使用皮尔森相关系数聚类
        treeheight_row = 30, # 设置行聚类树高
        cutree_rows =3, #根据样品列聚类情况将热图的行方向隔开为3份
        cellwidth = 40,cellheight = 15, # 设置热图单元格宽度和高度
        fontsize_number = 8, #热图上数值的字体大小
        number_color="blue", #热图上数值的字体颜色
        number_format="%.1e", #热图上数值的字体类型
        display_numbers = matrix(ifelse(data1 > 5000, "***", ""), nrow(data1)), #热图区块标记
        show_colnames = FALSE, # 设置行列标签的显示
        show_rownames = FALSE
        )

图14 设置热图标题及行列标签的显示

3.2.2.5.2 单元格边框及热图图例

使用“border” 与 “legend”设置热图单元格边框颜色及是否显示图例：

pheatmap(data1, 
          scale = "row", # 按行归一化，查看因子在不同样本中的分布情况
          cluster_cols = FALSE, clustering_distance_rows = "correlation", #取消列聚类，表示行聚类使用皮尔森相关系数聚类
          treeheight_row = 30, # 设置行聚类树高
          cutree_rows =3, #根据样品列聚类情况将热图的行方向隔开为3份
          cellwidth = 40,cellheight = 15, # 设置热图方块宽度和高度
         fontsize_number = 8, #热图上数值的字体大小
         number_color="blue", #热图上数值的字体颜色
         number_format="%.1e", #热图上数值的字体类型
         display_numbers = matrix(ifelse(data1 > 5000, "***", ""), nrow(data1)), #设置热图区分标记
         main="Test", # 设置图形标题
         show_colnames = FALSE, # 设置行列标签的显示
         show_rownames = FALSE,
         border="white", # 设置边框为白色
        legend = T, # FALSE去除图例; T显示图例
        legend_breaks=c(-2.5,0,2.5) # 设置图例的范围
         )

图15 设置热图单元格边框及图例的显示

3.2.2.5.3 字体及标签角度

使用“angle_col”设置标签的显示角度；
使用“fondsize”可以同一设置热图中字体的大小；
使用“fontsize_row” 与 “fontsize_row”可以分别设置行列标签字体的大小：

pheatmap(data1, 
          scale = "row", # 按行归一化，查看因子在不同样本中的分布情况
          cluster_cols = FALSE, clustering_distance_rows = "correlation", #取消列聚类，表示行聚类使用皮尔森相关系数聚类
          treeheight_row = 30, # 设置行聚类树高
          cutree_rows =3, #根据样品列聚类情况将热图的行方向隔开为3份
          cellwidth = 40,cellheight = 15, # 设置热图方块宽度和高度
         fontsize_number = 8, #热图上数值的字体大小
         number_color="blue", #热图上数值的字体颜色
         number_format="%.1e", #热图上数值的字体类型
         display_numbers = matrix(ifelse(data1 > 5000, "***", ""), nrow(data1)), #设置热图区分标记
         main="Test", # 设置图形标题
         show_colnames = T, # 设置行列标签的显示
         show_rownames = T,
         border="white", # 设置边框为白色
         legend = T, # FALSE去除图例; T显示图例
         legend_breaks=c(-2.5,0,2.5), # 设置图例的范围
         fontsize_row = 10, # 分别设置行列标签字体大小
         fontsize_col = 10,
         angle_col = 45, # 设置标签显示角度
         )

图16 设置热图字体及标签显示角度

3.3 特殊绘图——构建分组（注释功能）

这一段单独拿出来，可以进一步辅助绘制热图，从而直观的表达需要的信息，以后有时间再补充。

3.4 图片导出

保存格式包括pdf/jpeg/png格式，通过改变后缀的形式实现；
建议保存为pdf/jpeg格式，因为二者清晰度较高；
笔者喜欢pdf格式，便于利用AI等软件进行修饰。

pheatmap(data1, 
         scale = "row", # 按行归一化，查看因子在不同样本中的分布情况
         cluster_cols = FALSE, clustering_distance_rows = "correlation", #取消列聚类，表示行聚类使用皮尔森相关系数聚类
         treeheight_row = 30, # 设置行聚类树高
         cutree_rows =3, #根据样品列聚类情况将热图的行方向隔开为3份
         cellwidth = 40,cellheight = 15, # 设置热图方块宽度和高度
         #display_numbers = T, # 热图上显示数值
         fontsize_number = 8, #热图上数值的字体大小
         number_color="blue", #热图上数值的字体颜色
         number_format="%.1e", #热图上数值的字体类型
         #display_numbers = matrix(ifelse(data1 > 2, "+", "-"), nrow(data1))
         display_numbers = matrix(ifelse(data1 > 5000, "***", ""), nrow(data1)), #设置热图区分标记
         main="Test", # 设置图形标题
         show_colnames = T, # 设置行列标签的显示
         show_rownames = T,
         border="white", # 设置边框为白色
         legend = T, # FALSE去除图例; T显示图例
         legend_breaks=c(-2.5,0,2.5), # 设置图例的范围
         fontsize_row = 10, # 分别设置行列标签字体大小
         fontsize_col = 10,
         angle_col = 45, # 设置标签显示角度
         filename = "text.pdf" # 自动保存到设置路径下
         )

图17 保存图片

以上为关于 “pheatmap” 整理的全部内容，希望对大家有所帮助！

错误内容：

使用下列方式输入代码命名颜色时，利用pheatmap包是不会变更颜色的。

ann_color <- list(a<-c(DRY="yellow", WET="firebrick"))

正确的书写方式

ann_colors = list(Sample = c(M1="#E889BD", M2="#B286D7", M3="#5189E0", M4="#0089CF", M5="#0081A1", M6="#007360" ))

使用以下代码时，只有行可以划分为3部分，而列不能，大概是因为未对列进行聚类，使用gaps_col可对为聚类列进行隔断显示。

cutree_rows=3,
cutree_cols=6,
gaps_col = 3,

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